Разработка подхода гидролиза белка для повышения пищевой ценности свежеприготовленного мяса и рыбы.
Научная вспомогательная статья доктора Адриана Хьюсона-Хьюза | Советник по питанию, безопасности пищевых продуктов и инновациям, GA Pet Food Partners.
Введение.
Содержание животного белка хорошо известно как основа кормов высшего качества для собак и кошек, и многие владельцы домашних животных признают, что здесь применима поговорка «качество важнее количества». По данным исследовательской компании Mintel, 59% владельцев кошек и 57% владельцев собак говорят, что качество мяса важнее, чем общее содержание мяса в корме для домашних животных. (МИНТЕЛ, 2017 г.).
GA Pet Food Partners давно признал это. С момента введения Freshtrusion®, GA лидирует в разработке и производстве рационов, содержащих все больше свежеприготовленных источников белка из мяса и рыбы. Преимущества использования свежего мяса и рыбы по сравнению с сушеными, топлеными мясными и рыбными блюдами, в том числе лучший вкус и повышенная усвояемость, хорошо оценены как домашними животными, так и их владельцами.
Стремление предложить нашим Партнерам еще лучшие продукты.
Рынок кормов для домашних животных очень динамичен, и хотя подчеркивание точно высокой доли мяса/рыбы/птицы в продуктах является мудрым шагом, это становится базовым ожиданием, а не желаемым качеством этих продуктов от владельцев домашних животных. Здесь, в GA, мы постоянно ищем способы предложить Партнерам еще более качественные продукты, и именно поэтому мы решили сделать невозможное — придумать способ приготовления наших свежих мясных и рыбных ингредиентов, чтобы сделать их еще лучше для домашних животных. .
Идея состоит в том, чтобы повысить питательную ценность белка в наших свежих мясных и рыбных ингредиентах путем преобразования белка в небольшие пептиды, которые легче усваиваются домашними животными, поедая их (мы называем это «HDP» — легко усваиваемый белок). Чтобы помочь нам в этом стремлении, мы привлекли экспертов из Nofima, ведущего научно-исследовательского института по прикладным исследованиям продуктов питания, базирующегося в Норвегии, для оптимизации условий для ферментативного расщепления отобранного мясного и рыбного сырья и их анализа, чтобы продемонстрировать, что мы можем достичь того, чего хотим. .
Расщепление белков — также известное как протеолиз или гидролиз.
Белки представляют собой большие молекулы, состоящие из отдельных «строительных блоков», называемых аминокислотами. После употребления пищи, содержащей белок, начинается процесс протеолиза, так как ферменты, выделяющиеся в разных отделах желудочно-кишечного тракта, расщепляют его на аминокислоты и небольшие пептиды. Это позволяет этим строительным блокам всасываться в организм, где их можно рекомбинировать для создания новых белков (таких как мышцы, кожа, волосы, антитела, ферменты, гормоны и т. д.).
Источники белка также могут подвергаться контролируемому ферментативному протеолизу в рамках их подготовки к включению в промышленные пищевые продукты и пищевые продукты. Например, белковые гидролизаты десятилетиями использовались в питании человека, особенно в производстве гипоаллергенных молочных смесей для младенцев/детей с аллергией на белок коровьего молока.
Ферментативный или химический гидролиз
Гидролиз белка — разрыв пептидных связей, соединяющих аминокислоты, путем добавления воды — может быть достигнут различными методами: химическим путем с использованием кислот или оснований (щелочной) или ферментативным (подход, на котором мы сосредоточимся). Хотя методы кислотного и щелочного гидролиза белков обладают преимуществом низкой стоимости, они имеют негативные последствия с точки зрения питательного качества полученных гидролизатов. Кислотный гидролиз приводит к полному разрушению незаменимой аминокислоты триптофана, а также к частичной потере метионина, цистина и цистеина. (Пасупулеки и Браун, 2010 г.). Точно так же щелочной гидролиз приводит к полному разрушению большинства аминокислот, хотя триптофан может оставаться неповрежденным. (Дай, и другие, 2014) (Хоу, и другие, 2017).
По сравнению с кислотным и щелочным гидролизом основными преимуществами ферментативного гидролиза белков являются:
- Условия гидролиза, такие как температура и рН, являются мягкими и не приводят к какой-либо известной потере аминокислот.
- Использование фермента(ов) протеазы более специфично и точно контролирует степень гидролиза и размер пептидов.
- Небольшие количества используемого фермента можно легко деактивировать (например, нагреванием до 80–85ºC в течение не менее 3 минут), чтобы остановить реакцию гидролиза. (Хоу, и другие, 2017).
Питательные преимущества ферментативно гидролизованного белка: усвояемость и усвоение белка.
В дополнение к используемому методу гидролиза белка, как указано выше, питательная ценность белковых гидролизатов зависит от состава присутствующих свободных аминокислот, малых пептидов (обычно ди- и трипептидов) и больших пептидов. Исторически считалось, что только свободные аминокислоты всасываются из желудочно-кишечного тракта специфическими переносчиками аминокислот. Это действительно происходит, но в настоящее время признано, что большинство аминокислот поглощаются в виде ди- и трипептидов переносчиком пептидов широкой специфичности PepT1. (Фэй, и другие, 1994). PepT1 потенциально может транспортировать все 400 дипептидов и 8,000 трипептидов, образующихся в результате комбинирования 20 различных диетических аминокислот. (Дэниел, 2004 г.). Следовательно, можно ожидать, что прием гидролизата белка, содержащего большое количество ди- и трипептидов, будет способствовать перевариванию и усвоению белка, что приведет к повышению усвояемости и биодоступности аминокислот.
Ясно, что создание наилучших условий фермента и гидролиза имеет решающее значение для возможности создания гидролизатов белка с желаемыми профилями конечного размера пептида. Распределение пептидов по размерам можно определить с помощью метода, называемого эксклюзионной хроматографией. Эксклюзионная хроматография (ЭХ) — это метод аналитической химии, при котором смеси молекул (таких как белки или пептиды), растворенные в растворе, разделяют по размеру (как показано на рисунке 1).
РИСУНОК 1. Простой обзор разделения молекул разного размера в растворе с помощью эксклюзионной хроматографии (ЭХ). Раствор наносится на колонку, заполненную смолой в виде пористых сферических шариков (серые шарики). Крупные молекулы (красные кружки) не смогут проникнуть в поры (отверстия) шариков и, следовательно, относительно быстро пройдут вниз по колонке и будут обнаружены первыми. Меньшие молекулы в образце могут проникать в поры в разной степени в зависимости от их размера. Молекулы «среднего размера» (зеленые кружки) смогут проникнуть в одни гранулы, но не в другие, поэтому им потребуется больше времени для прохождения через колонку, в то время как самые маленькие молекулы (синие кружки) смогут проникнуть во все поры и пройдут через колонку. самый длинный, чтобы пройти через колонку.
методы
сырье – Свежие образцы куриной тушки, утиной тушки и каркаса лосося были измельчены, гомогенизированы в густую пасту и заморожены. Свежую баранью печень замораживали целиком. Материалы были отправлены на Нофима, Ås, Норвегия, для протеолиза и анализа.
протеолиз – Для каждого вида сырья (курицы, утки, лосося и баранины) 500 г образца смешивали с 990 мл дистиллированной воды в стеклянном реакционном сосуде и перемешивали со скоростью 300 об/мин. Для каждого сырья были протестированы три различных протеазных фермента в двух различных концентрациях и в двух временных точках, в результате чего было получено 48 образцов гидролизата для анализа.
Эксклюзионная хроматография – Молекулярно-массовое распределение водорастворимой белковой фракции гидролизатов определяли методом эксклюзионной хроматографии с использованием системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Shimadzu LC-20AT с матричным фотодиодным детектором (SPD M20A), настроенным на 214 нм.
Содержание коллагеновых пептидов – Гидроксипролин представляет собой модифицированную аминокислоту, присутствие которой в основном ограничивается коллагеном. Содержание гидроксипролина в белковых гидролизатах можно использовать в качестве косвенного показателя количества присутствующих коллагеновых/коллагеновых пептидов. Полный аминокислотный анализ (включая гидроксипролин) каждого сырья был проведен Nofima Biolab; кроме того, в аккредитованной лаборатории (ALS, Норвегия) определяли содержание гидроксипролина в водорастворимой фракции гидролизатов.
Результаты
Распределение размеров пептидов гидролизатов – В целом, для каждого протестированного фермента инкубация каждого исходного материала с более высокой концентрацией фермента и в течение более длительного времени приводила к «положительному» сдвигу в профиле размера пептидов гидролизатов (т. е. к увеличению доли более мелких пептидов). ). Это показано на Рисунке 2, где показаны результаты для каждого сырья с использованием «лучшего» фермента при «неоптимальной» концентрации и продолжительности по сравнению с «оптимальной» концентрацией и продолжительностью. При оптимизированных условиях мы обнаружили, что 100% пептидов имели вес ≤3 кДа, а более 75% имели вес <0.5 кДа (рис. 2).
На основе коллективных данных нескольких исследований на ряде видов (например, на крысах, свиньях, собаках, людях; см. (Чжанги и Мэтьюз, 2010 г.) для обзора обычно принято, что:
- Всасывание пептидов лучше по сравнению с интактным белком.
- Усвояемость пептидов лучше, чем свободных аминокислот.
- Всасывание малых пептидов лучше, чем больших пептидов.
Физиологически большинство аминокислот усваивается в виде небольших пептидов, состоящих из 2 или 3 соединенных вместе аминокислот (соответственно ди- и трипептиды). Следовательно, можно ожидать, что прием гидролизата белка, содержащего большое количество ди- и трипептидов, будет способствовать перевариванию и усвоению белка, что приведет к повышению усвояемости и биодоступности аминокислот. Средняя молекулярная масса аминокислоты составляет 110 дальтон (Да), поэтому молекулярная масса ди- и трипептидов должна составлять примерно 220–330 Да (0.2–0.3 кДа). Наши результаты в получении белковых гидролизатов с более чем 75% пептидов размером менее 0.5 кДа (т.е. до ~ 5 аминокислот) означают, что белок в наших гранулах будет легко усваиваться и легко усваиваться домашними животными, которые его едят. Планируется продемонстрировать это с помощью исследования кормления в сотрудничестве с факультетом ветеринарной медицины Гентского университета.
Кроме того, достижение 100% пептидов с молекулярной массой 3 кДа или меньше снижает риск возникновения аллергической реакции на источники белка и поэтому может считаться гипоаллергенным.
Рисунок 2.
Распределение размеров (кДа) пептидов в водной фазе гидролизатов каждого сырья, инкубированных с одним и тем же ферментом в «неоптимизированных» и «оптимизированных» условиях с точки зрения концентрации фермента и продолжительности гидролиза. Обратите внимание, в частности, как процент пептидов между 1.0-3.0 кДа уменьшается и пептидов <0.5 кДа увеличивается при переходе от «неоптимизированных» к «оптимизированным» условиям.
Содержание коллагеновых пептидов
Для каждого тестируемого сырья ферменты А и С в целом работали «лучше» (с точки зрения извлечения большего процента гидроксипролина в водной фазе гидролизатов), чем фермент В, при сравнении заданной продолжительности гидролиза и концентрации фермента (например, см. результаты для лосося на рисунке 3).
Поскольку «неповрежденный» белок коллагена не растворяется в воде, присутствие гидроксипролина (наш маркер «коллагена») в водной фазе указывает на то, что белок коллагена был переварен в пептиды коллагена (которые растворимы в воде). Наши результаты показывают, что мы можем использовать ферментативный протеолиз для создания сырья, способного приносить потенциальные функциональные преимущества, такие как поддержание здоровья суставов, здоровья кожи и кишечника благодаря присутствующим в них коллагеновым пептидам.
Рисунок 3. Процентное содержание гидроксипролина (аминокислоты, встречающейся почти исключительно в коллагене), восстановленной в водной фазе гидролизованного лосося с тремя различными ферментами (А, В или С), инкубируемого с сырьем (лососем) при двух различных концентрациях (С1 или С2) в течение два разных периода времени (T1 или T2).
Заключение
Эти положительные результаты открывают возможности для получения дополнительной ценности от естественного присутствия коллагена в определенных сырьевых материалах путем создания пептидов коллагена, обладающих функциональными преимуществами, такими как поддержание здоровья суставов у активных домашних животных и улучшение подвижности и гибкости суставов у пожилых животных, для пример.
Учитывая высокий процент (>75%) малых пептидов (<0.5 кДа), полученных в «оптимизированных» условиях, основанных на этом исследовании, первая часть нашего исследования HDP цель достигнута. Следующим важным шагом является демонстрация того, что гранулы, приготовленные с использованием этого HDP, действительно более усваиваемы и биодоступны, чем наши существующие свежеприготовленные продукты. Университет Гента Ветеринарная школа. Следите за этим пространством!
Референсы
- Кейв, Н., 2006. Диеты с гидролизованным белком для собак и кошек. Практика мелких животных ветеринарных клиник, том 36, стр. 1251-1268.
- Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. & Wu, G., 2014. Анализ аминокислотного состава в белках животных тканей и пищевых продуктов в виде предколоночных производных о-фталдиальдегида методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием. J Хроматография В, том 964, стр. 116-127.
- Daniel, H., 2004. Молекулярная и интегративная физиология транспорта пептидов в кишечнике. Ежегодный обзор физиологии, том 66, стр. 361-384.
- Fei, Y. et al., 1994. Экспрессионное клонирование протонно-связанного олигопептидного переносчика млекопитающих. Nature, Volume 7, pp. 563-566.
- Ханаока, К. и др., 2019. Характеристика молекулярной массы белков и пептидов при производстве вкусовых добавок для кормов для домашних животных. [Онлайн] Доступно по адресу: https://www.diana-petfood.com/emea-en/publications/
- Хоу, Ю. и др., 2017. Гидролизаты белков в кормлении животных: промышленное производство, биоактивные пептиды и функциональное значение. Журнал зоотехники и биотехнологии, стр. 24-36.
- Knights, R., 1985. Обработка и оценка белковых гидролизатов. В: Питание для особых потребностей. Нью-Йорк: Марсель Деккер, стр. 105–115.
- MINTEL, 2017. Повышение прозрачности с точки зрения содержания белка в кормах для домашних животных, sl: MINTEL REPORTS.
- Пасупулеки, В.К., Браун, С., 2010. Современное производство белковых гидролизатов. В кн.: Белковые гидролизаты в биотехнологии. Нью-Йорк: Спрингер, стр. 11-32.
- Zhangi, B. & Matthews, J., 2010. Физиологическое значение и механизмы всасывания гидролизата белка. В кн.: Белковые гидролизаты в биотехнологии. Нью-Йорк: Спрингер, стр. 135-177.